生物、医药和医疗器械技术

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种水蛭素接枝纳米纤维血管支架材料、制备方法与应用。制备方法包括：(1)将宽体金线蛭冻干后粉碎，用PBS缓冲液提取过滤得到水蛭素粗提液；(2)将水解角蛋白和三(2‑羧乙基)膦盐酸盐一同加入到水蛭素粗提液，透析后，截留液加热后冻干，得到水蛭素接枝人发角蛋白；(3)将水蛭素接枝人发角蛋白溶于六氟异丙醇，静电纺丝后，得到纳米纤维血管支架材料。该纳米纤维支架将水蛭素固定化，能局部过滤血液中的凝血酶，具有抗凝血的效果。

水蛭素是水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65‑66个氨基酸组成的小分子多肽。水蛭含有丰富的水蛭素，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。水蛭素具有极强的抑制凝血作用和抗血栓形成作用，在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着广阔的应用前景。

此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)水蛭素的N末端有3对二硫键，使N末端肽链绕叠成密集的环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。水蛭素C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。本申请利用水蛭素结构特征，将二硫键断开，并与角蛋白上的半胱氨酸重新连接，接枝使水蛭素的蛋白结构更加稳固。同时不影响水蛭素C末端的10个氨基酸，其为实现水蛭素功能必需的最小结构，C末端的最佳大小至少是12个氨基酸(Hir54‑65)，在这一序列中每个氨基酸都非常重要。此外，利用三(2‑羧乙基)膦盐酸盐同时将水蛭素N端和角蛋白中的二硫键断开，实现重构，能够实现交错的网络结构，完成了水蛭素的固定化。

2)将水蛭素固定在纳米纤维中，可以实现局部抗凝血，防止因水蛭素过量导致的副作用的发生，使水蛭素能够用于贫血患者。

3)采用纳米纤维接枝固定化水蛭素，能够最大化反应的表面积，实现水蛭素抗凝血功能。