生物、医药和医疗器械技术

本发明涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪pCD163的细胞系，通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。所述的细胞系在临床分离PRRSV病毒和生产PRRSV疫苗中的应用。本发明构建的pCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了PRRSV增殖率低的局限性；对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。现阶段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。

PRRSV表现出相当严格的细胞嗜性，PRRSV在感染猪体时，其主要的靶细胞为肺泡巨噬细胞（PAM），在体外培养时，则只能在CL2621、MARC-145等细胞中增殖。PAM非常容易感染PRRSV，但是PAM难于获得且只能原代培养，操作成本高昂，无法在PRRSV的疫苗生产中使用；MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但是存在着增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的局限性。

CD163是PRRSV细胞受体，可以单独介导PRRSV的吸附和内吞。研究发现，将 CD163分子导入PRRSV非易感细胞，使该细胞表达CD163蛋白后就能够感染并增殖PRRSV，成为PRRSV易感细胞。CD163在MARC-145细胞中的表达量很低，导致了MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低。

本发明的有益效果是：（1）本发明构建的pCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了以往MARC-145细胞系PRRSV增殖率低的局限性；

（2）通过病毒增殖实验证明，在相同的条件下，本发明构建的pCD163-MARC细胞系对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。