生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了鸡细小病毒、禽流感病毒和鸡新城疫病毒三重PCR检测方法的建立。本发明提供了成套引物，其由引物1至引物6组成。本试验所建ChPV、AIV 和NDV三重PCR方法可以用于临床ChPV、AIV和NDV的混合感染的快速检测，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

禽流感(Avian influenza,AI)是禽流行性感冒的简称，是一种由A型流感病毒引起的禽类传染病，通常表现为突然发病且无明显症状；病程稍长则有明显的神经系统、消化道、呼吸道和生殖道等症状，并可能伴随有采食量减少，产蛋量下降，且易感染并发其他疾病，造成严重的经济损失。禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) 为由8个独立节段组成的单股负链RNA，包含HA、NA、M、PB1、PB2、NP、PA、NS。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种多病型的急性、高度接触性传染病。当禽类感染NDV时，发病急，病情重，常出现高热、黏膜出血、呼吸困难及下痢等症状，且引起较高的死亡率。NDV 由一条不分节段的单股负链RNA组成，包含NP、P、M、F、HN和L，共6种结构蛋白。目前，AI和ND是影响养禽业发展的主要疾病，我国已将其列为一类动物疫病，也是我国规模化鸡场的常发病和多发病。AI与ND均由病毒感染引起，冬春两季高发，具高度传染性，因二者在症状上形似，故感染ND的鸡群易被养殖户误认为AI，导致因处理措施选择不当从而延误了鸡群病情。

鸡细小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是引起鸡肠道类疾病的重要病原体之一，可以引起鸡群出现以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、增加饲料消耗等为特征的急性或慢性肠道性疾病、营养不良综合征、发育不良与矮小综合征  (runting and stunting syndrome,RSS)。ChPV在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，其中商品肉鸡感染率较高，蛋鸡或种鸡次之。自2010年以来，北美、波兰、匈牙利、巴西、克罗地亚，韩国 等国家相继暴发了该病，给养鸡业造成较大的经济损失。

本发明针对ChPV NS1基因、AIV M基因和NDV F基因的保守序列设计引物，能够同时扩增出ChPV、AIV和NDV的3段特异性片段，长度分别为687、239和453bp，目的片段之间具有明显的长度差异(＞100bp)，在同一体系中便于鉴别，且每一对引物的扩增效率高、特异性强。本试验建立的方法能够检测到样本中ChPV、AIV和NDV 核酸，因此，可用于监控鸡群感染ChPV、AIV和NDV后的排毒情况及临床上ChPV、AIV 和NDV流行病学的监测。在鉴定三重PCR1 2的敏感性时，将三重PCR与单重PCR的核酸最低检测量进行对比，相应减少了1×10 ～1×10个数量级，仍具有很高的敏感性 (可以检测到ChPV、AIV以及NDV核酸的最低含量分别为6.4、2.0、2.5pg)，完全可以满足疫病检测的要求。在临床检测中往往以粪便(棉拭子)为样品，但是由于粪便中含有多种抑制PCR反应因子，因此建议使用商品化的核酸提取试剂盒以获得较好质量的核酸。此外，为了减少样品的假阴性，采样后应对样品尽快进行处理，且将样品置于低温条件下运输、保存。该方法可以在同一份样品中同时检测出三种病原体，符合临床上对多种疾病的同步诊断的要求，对于这三种病的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的临床应用价值。本试验所建立的ChPV、AIV和NDV三重PCR方法可以用于临床ChPV、AIV和NDV的混合感染的快速检测，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。