生物、医药和医疗器械技术

本发明专利是采用Taqman探针进行荧光定量，PCR反应过程中,引物与模板DNA特异性结合、延伸。当引物到达TaqMan探针的靶位点时,Taq聚合酶酶解TaqMan探针中FAM染料与猝灭剂之间的化学键,使FAM染料释放并荧光发出,同时探针被降解。因此通过TaqMan探针荧光定量PCR技术能够快速、准确地检测和定量APV基因。该方法能检测到APV，没有检测到其它禽病病原，特异性好，检测的限量为10个拷贝的禽肺炎病毒质粒，敏感性高。

禽肺炎病毒（avian pneumovirus，APV）是禽偏肺炎病毒属的成员，属于禽副黏病毒科，该病毒主要危害火鸡，但是近几年发现这种病毒也侵害不同品种的鸡，包括种鸡、商品肉鸡和鸡蛋，引起这些鸡发病。该病毒引起鸡发病的日龄一般在4-7周龄，在5-6周龄时最易发生。主要引起上呼吸道的症状，以喷嚏，眼结膜潮红，泪腺肿，明显的症状为头部出现皮下水肿，出现头部肿大；产蛋鸡感染该病毒主要引起产蛋下降，下降幅度在2%-40%之间，种蛋孵化率降低；随着病情的发展，会出神经症状；该病引起的发病率在1%-90%之间，引起鸡死亡率在1%-20%，如继发其它疾病的感染，引起的死亡会更大，对养禽业造成的危害极大。

禽肺炎病毒基因组为不分节段的负链RNA，长度约为14kb，根据其核苷酸和氨基酸序列可以将其经典的分为A、B、C、D等4个亚型，其中A亚型和B亚型呈世界范围内广泛流行，C亚型于1997年在美国科罗拉多分离，D亚型仅存在于法国。其基因组编码有8种蛋白，即N-P-M-F-M2-SH-G-L。其中F为融合蛋白，是该病毒主要抗原结构蛋白，具有吸附作用。

实时荧光定量PCR是一种融PCR和DNA探针杂交技术为一体的基因体外扩增技术，它通过实时检测PCR产物荧光信号的变化而达到检测病原核酸的目的，该技术具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为动物病原检测的重要方法。另外，该技术还可以根据建立的标准曲线，直接从检测到的荧光阈值推算样品中相应病原的含量，在临床检测和对疾病进程的评价上具有很高的实用价值。

本发明具有如下优点：

1）检测时间短

本研究通过Primer Express3.0软件，设计扩增禽肺炎病毒的引物和探针，通过比对分析设计的引物之间的二聚体、发夹结构等，最终设计出了1对引物和一条Taqman 探针。建立了禽肺炎病毒的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法。该方法无需进行电泳，仅需要约30分钟的时间完成扩增，并且可以直接通过电脑来观察反应结果，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后需要花2小时进行凝胶电泳来观察结果。

2）检测特异性强且敏感性高

采用Taqman探针建立的荧光定量PCR方法，在扩增时形成的引物二聚体不影响检测结果，无需进行溶解曲线分析引物二聚体的形成，在扩增退火时检测荧光，扩增特异性强。用该方法对禽肺炎病毒毒株和其它禽的毒株进行检测，只有禽肺炎病毒毒株核酸出现特异的曲线，为阳性，其它对照毒株核酸均没有曲线出现，为阴性，结果特异性好；用建立的Taqman探针荧光定量RT-PCR方法对样品中禽肺炎病毒的含量进行定量，其检测的敏感性非常高，能检测到限量为10个拷贝的禽肺炎病毒质粒，常规PCR为1000个拷贝。建立的方法可用于禽肺炎病毒的鉴别检测，因此该方法的建立对禽肺炎病毒的准确诊断和预防有重要意义。