生物、医药和医疗器械技术

检测鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光PCR试剂盒，具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点，可用于临床上鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测。

鸭I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I，DHV I)是雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病的病原。该病主要侵害4周龄以内的雏鸭，死亡率高达90％以上，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。番鸭细小病毒(Muscovy duckling parvovirus，MDPV)，是危害番鸭养殖的重要病原，可引起1周龄-3周龄雏番鸭发病，致死率可达到50％-80％。这两种病毒是雏鸭最易感并且致死率也非常高的病毒。鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒是危害雏鸭的最重要病原，并且感染发病后致死率非常高，因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。

目前，这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。

本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有如下优点：

1)检测时间短译

本研究通过Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，筛选出了2套探针和引物。对筛选出的2套探针和引物进行不同浓度的配比，选出了其最佳引物和探针的浓度组合，建立了鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法实现了一管二检的目的，并且反转录和PCR是一步完成，仅需要约30分钟的时间，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后需要花2小时进行凝胶电泳来观察结果；

2)检测敏感性高且特异性强

当鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒同时存在时，所建立的方法对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检出及检出的敏感性。另外，建立的方法可以对样品中相应的病原含量进行定量，并且检测的敏感性非常高，均能检测到200个拷贝的鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒，比常规PCR方法敏感性高10倍，可用于鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此该方法的建立对鸭I型肝炎病毒和番鸭细小病毒的防治有重要意义。