生物、医药和医疗器械技术

牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒,采用环介导等温扩增(LAMP)技术,并根据折光马尔太虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增,即可检测出牡蛎折光马尔太虫,解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷,具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单,特别适于基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。

折光马尔太虫(Marteilia refringens)对牡蛎养殖的危害较大，可引起贝类消瘦、消化道变色、停止生长并死亡，大洋洲和欧洲等国家其感染现象普遍存在。

折光马尔太虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起折光马尔太虫PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，，因而难以适应基层现场检测需要。

本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据折光马尔太虫共有的基因保守区(见序列表SEQ.ID.No.1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此发明了用于快速检测牡蛎折光马尔太虫的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎折光马尔太虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎折光马尔太虫。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。

另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性：一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了SYBR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。