生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了用于鉴别牛支原体和传染性鼻气管炎的引物组合及其应用。本发明根据MB和IBRV的保守基因序列,设计并合成两套特异性LAMP引物,在每条内引物的5’端标记荧光基团,建立了MB和IBRV二重荧光LAMP方法,通过观察扩增产物颜色即可诊断MB和IBRV。

牛支原体(Mycoplasma bovis，MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)是牛呼吸综合症常见的两种主要病原，是危害养牛业最为严重的疾病之一，制约着全球养牛业的发展。牛传染性鼻气管炎病毒(bovine herpesvirusⅠ，IBRV)主要引起牛高热、鼻炎、呼吸困难和母畜流产等疾病，我国将其列为二类动物疫病。IBRV在我国属于外来病，由国外引种而导致的。牛支原体(Mycoplasma bovis，MB)主要引起牛呼吸困难、气喘、咳嗽，同时还可引起关节炎、乳房炎、生殖道炎、角膜结膜炎、耳炎等。MB的暴发几乎都与运输有关，牛群一旦感染发病或青年牛潜伏感染后很难被清除，感染牛支原体的牛可携带病原体数月，甚至数年而成为一个传染源。像很多其它疱疹病毒一样，IBRV常有隐性感染，当遇到传染性疾病，运输或是皮质类固醇的应激时IBRV便可复发，与MB混合感染继发细菌性支气管炎，可导致灾难性死亡。有研究表明，之前接触过IBRV会使牛对MB更加易感。两种病临床症状态相似难以区分，且经常混合感染，所以常常因为不能得到及时正确的诊断和有效的治疗，而造成很大的经济损失。因此鉴别诊断对牛呼吸综合症的防治显得尤其重要。当前对这两种牛病原体的诊断方法主要有病毒分离、血清中和、Elisa及PCR等方法，但国内外还没有有关牛支原体和牛传染性鼻气管炎的二重方法的报导。

环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，突破了恒温扩增的技术难点，6条引物同效率时增，敏感性高，特异性好，已在多种疾病的检测上得到应用。目前，国内的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能确定具体到底是哪一种阳性反应所引起的结果，不是真正意义上的鉴别诊断。

本发明根据MB和IBRV的保守基因序列，设计并合成两套特异性LAMP引物，在每条内引物的5’端标记荧光基团，建立了MB和IBRV二重荧光LAMP方法，通过观察扩增产物颜色即可诊断MB和IBRV。通过实验证明：本发明的方法简便、快速，灵敏度高(最低能检测到100个混合模板拷贝/反应)，特异性好，重复性好，成本低，可同时检测大量样本，且与其它牛病原体无交叉反应。应用该方法检测125份样品，MB的感染率为44.8％，IBRV的感染率为13.6％，2种病原混合感染率为1.6％；与OIE推荐的单重荧光定量PCR检测方法相比，此二重LAMP方法的敏感性为94.4％～96.6％，特异性为100％。本发明的方法可用于MB和IBRV的临床检测和流行病学调查，不仅有助于了解牛支原体和牛传染性鼻气管炎的流行情况，评估其对我国养牛业的潜在危害，也为我国牛支原体和牛传染性鼻气管炎防控方案的制定提供依据。