生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT-LAMP检测组、试剂盒及其应用,该二重荧光RT-LAMP检测组包括2组特异性引物和探针,其中第一组特异性引物和探针包括FMDV-F3,FMDV-B3,FMDV-FIP(F1c-F2),FMDV-BIP(B1c-B2),和FMDV-探针,第二组特异性引物和探针包括BTV-F3,BTV-B3,BTV-FIP(F1c-F2),BTV-BIP(B1c-B2)和BTV-探针,所述2组特异性引物和探针依次如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease，FMDV)引起的偶蹄类动物共患的急性高度接触性传染病，具有传播广、发病急、危害大等流行病学特点，主要感染牛、猪、羊和骆驼等个20科的70多种家养和野生哺乳动物。蓝舌病是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的反刍动物非接触性传染病，可通过库蠓等昆虫染感宿主，主要感染绵羊、牛及野生反刍动物。两种病毒感染动物均表现为体温升高，精神沉郁，口腔黏膜、乳头和蹄部出现水泡溃烂，症状相似，难以区分。被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，在中国被列为一类动物疫病。FMDV一旦暴发，只能通过屠宰和集体焚毁的方式进行处理，BTV一般呈隐性感染，但在我国多个省份广泛存在，时时危害着畜牧业的健康发展。

LAMP是2000年Notomi等人开发出的一种新型核酸扩增方法，恒温扩增，操作简便，反应快速，成本低，已广泛应用在疾病诊断和基因筛选中。但LAMP由于其结果判定方法的局限(浊度，颜色，加染料)，多重LAMP方法一直未有较大进展。虽然目前国内外多位学者已建立了多重LAMP检测方法，但这些方法都有一定的不足：只能检测样品是否带病，但不能确定具体是哪一种病原引起的结果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明涉及的RT-LAMP检测组采取的是一种新的技术路线：在FIP与BIP之间添加Taqman探针，反应前荧光基团与淬灭基因紧密相邻，此时探针中的荧光基团不发光，LAMP反应中，探针分子杂交到靶序列上，引物延伸，使探针断裂，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团发光。LAMP扩增效率极高，扩增产物的数量比real-time PCR多，断裂的探针数量多，因此能在反应管内凭肉眼可直接读取反应结果，不需要电泳，且荧光基团所显示颜色的不同能准确鉴别两种病毒。该二重荧光RT-LAMP检测组的优点：1继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低。2特异性高：探针的杂交比引物扩增更特异，能有效抑制假阳性结果。通常当延长LAMP反应时间，由于引物间相互缠绕，反应会出现非特异性扩增。在研究中，发明人尝试延长反应时间至120分钟，在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，非特异性扩增的反应管内探针不断裂，因此不能发光，由此可见该二重荧光RT-LAMP方法特异性较好。3减少污染，反应后直接凭肉眼读取反应结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP的污染。4结果准确：本研究使用了两种荧光基团，FAM和CY5.5，这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FAM吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为694nm，呈大红色不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FAM，无法观察到CY5.5。比仅凭沉淀物观察，电泳等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。

(2)本发明用FMDV和BTV病毒体外转录RNA对二重荧光RT-LAMP检测方法的特异性、敏感性等方面进行评估，用临床样品和模拟混合感染样品验证方法的临床检测效果。结果显示，两种病毒体外转录RNA最低检测限为200拷贝/反应；特异性好，与其它病毒无交叉反应；干扰性小，可同时检测到两个模板浓度不同的样品；该方法方便快捷，全程仅需一台水浴锅90分钟完成反应，且不需要电泳，肉眼直接观察反应产物判断结果；与OIE推荐荧光定量RT-PCR方法检测符合率100％。结果表明本研究建立的FMDV和BTV多重荧光RT-LAMP具有良好的特异性，敏感性和重复性，可用于条件简陋的基层检疫。