生物、医药和医疗器械技术

本发明是一种用于鉴定检测牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒三种病原的引物组及其应用。采用牛支原体引物对和牛病毒性腹泻引物对和牛传染性鼻气管炎引物对,通过三重二温式PCR检测三种牛常见呼吸道病原体,具有特异性好、灵敏度高、普适性好、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查。本发明为牛病的防控提供了新的技术方法,具有很高的临床应用价值。

牛呼吸综合症(bovine respiratory disease complex，BRD)是危害养牛业最为严重的疾病之一，时时刻刻制约着全球养牛业的发展。牛呼吸综合症主要危害犊牛、肉牛和奶牛，具有发病率和死亡率高的特点，给养牛业造成惨重的经济损失。牛呼吸综合症通常由一种或数种病原单独或混合感染引起的，牛支原体(Mycoplasma bovis，MB)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea，BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(bovine herpesvirusⅠ，IBRV)是牛呼吸综合症最常见的3种主要病原体。

牛支原体可引起犊牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和关节炎，以引起呼吸系统疾病最为多见。牛支原体通常存在于牛的呼吸道和生殖道中，当牛因环境变化或其他应激因素免疫力低下时容易引起感染发病，还伴有多种细菌和病毒的混合感染，可引起牛呼吸系统疾病及乳腺疾病。据报导，欧美国家约四分之一到三分之一的牛呼吸综合症都是由牛支原体引起的，每年所造成损失达1.40亿美元，单个牛场感染率最高达70％。在欧洲每年约25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，每年损失大约1.44亿～1.92亿欧元，其中英国患牛支原体肺炎的牛只每年大约有190万头，死亡达15.7万头，单个牛场最高感染率达70％。

多重PCR是一种高效的PCR，可在同一个PCR反应管内，同时鉴别检测多种病原体，在多种病原混合感染的鉴别诊断上具有很高的优势和临床实用价值。二温式PCR是在常规PCR基础上发展而成的更简便的PCR检测技术，二温式PCR将退火和延伸在同一温度下完成，退化温度比常规三温式PCR的高，因此不仅提高了PCR的特异性，且二温式PCR省略了反复升温降温的时间消耗，节省时间，提高疾病的诊断效率。本发明提供的方法，全程只需一次抽提、一次PCR、一次电泳即可检测两种病原，非常适合混合感染的样品，省时省力。

近几年养牛饲业规模的不断扩大，疫病防治工作正面临着前所未有的压力，需要简便、快速、高通量检测技术以保证养牛业的健康发展。本发明提供了用于鉴定牛支原体(MB)的引物对甲、用于鉴定牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的引物对乙和用于鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物对丙，并基于三个引物对开发了三重二温式PCR方法。采用引物对甲、引物对乙和引物对丙，通过三重二温式PCR检测牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒，具有特异性好、灵敏度高、普适性好、方便快速等优点，可用于临床鉴别诊断和流行病学调查。本发明为牛病的防控提供了新的技术方法，具有很高的临床应用价值。