生物、医药和医疗器械技术

本发明是一种用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用。本发明的引物组合由FMDV引物组和VSV引物组成。FMDV引物组由引物FMDV-F3、FMDV-B3、FMDV–FIP和FMDV-BIP组成。VSV引物组由引物VSV-F3、VSV-B3、VSV-FIP和VSV-BIP组成。本发明还保护所述引物组合在鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒中的应用、鉴定待测病毒是否为口蹄疫病毒或水泡性口炎病毒中的应用、鉴定待测样本是否感染了口蹄疫病毒和/或水泡性口炎病毒中的应用。

口蹄疫和水泡性口炎是牛的高度急性病毒传染病，一般呈暴发性流行,给畜产品贸易和养牛业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的。水泡性口炎是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)引起的。FMDV和VSV在临床上常存在混合感染，均表现为精神不撅，体温升高，口腔、乳头和蹄部冠状带等处发生水泡及溃疡，临床症状十分相似，难以区分。因此急需建立口蹄疫和水泡性口炎的快速鉴别检测技术，为我国FMDV和的VSV防控提供技术支持。

FMDV包括7个血清型：O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和AsiaⅠ型，目前国内流行的为O型、A型和AsiaⅠ型。VSV分为两种血清型，NJ型(新泽西型)和IND型(印第安型)，在引起家畜发病的血清型中，NJ型占多数。

目前OIE推荐通过病毒分离、ELISA、RT-PCR、荧光RT-PCR等方法检测FMDV和VSV。病毒分离虽然是检测的黄金标准，但耗时耗力。RT-PCR和荧光RT-PCR快速准确，但成本较高，需要昂贵的仪器设备。环介导的体外等温扩增检测技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在PCR方法上发展起来的新兴核酸检测技术，实现了在恒温条件下方便、快速、灵敏、特异的检测，已在多种主要动物病原体检测上得到应用，可在条件贫乏的基层使用。目前，国内尚未有二重RT-LAMP检测技术的研究报导。

近几年随着我国畜牧业高速发展，养牛饲业规模的不断扩大,疫病防治工作正面临着前所未有的压力,需要简便、快速、高通量检测技术以保证养牛业的健康发展。LAMP技术是基于PCR技术发展起来的一种新型核酸扩增技术，该技术克服了传统PCR技术的一些缺点，具有简便、快速、特异性高和成本低的优点。反应只需一台水浴锅中2小时即可完成，结果可凭肉眼直接观察，已经应用在多种微生物的检测。本发明的发明人设计了多套引物，优化筛选特异性引物组合，最终成功建立了在同一反应管里鉴别诊断口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重RT-LAMP检测方法。采用本发明提供的引物组合和方法鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒特异性好(能高效扩增目的基因，而对其它病原核酸无扩增)、灵敏度高(最低能检测到100个FMDV和100个VSV RNA拷贝)。

多重PCR的扩增效率受到多方面因素的影响，特异性引物的设计是多重PCR成功的关键。本发明的发明人将FMDV和VSV的不同浓度模板进行组合，探讨了高浓度模板对低浓度模板是否存在抑制。发现控制反应体系中引物的用量，可大大抵制干扰性，即使高浓度模板优先反应，也会因引物耗尽而停止扩增，把反应体系留给低浓度的另一模板，达到同时扩增高浓度模板和低浓度模板而不相互不受干扰效果，不影响二重RT-LAMP反应系的扩增效果。

本发明所建立的二重RT-LAMP方法是一种简便，快速，低成本的诊断方法，能在同一个反应管内检测FMDV和VSV。可用于条件不好的基层和现场检疫，也适用于大规模的流行病学调查。