生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，其中引物5和引物6为taqman 探针，它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与NDV强毒和弱毒的 F基因裂解位点杂合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光，从而实现快速敏感特异的鉴别NDV强弱毒株。据此，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光LAMP方法。总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的以感染禽类为主的一种急性、烈性传染病。尽管新城疫只有一个血清型，但是不同毒株之间的生物学特性存在明显差异。目前主要以NDV F蛋白的裂解位点为鉴别NDV强弱毒株的分子标记。

传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop‑mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛运用。传统的LAMP检测方法中，创新性的加入taqman探针，反应时特异性的taqman探针会与扩增产物杂合并随着扩增进行过程水解，发出荧光。

目前，国内外均未见有建立二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。“新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立”虽然报道了通过LAMP区分NDV强弱毒，但是该法需要3套不同的引物，并且检测时需要在3个不同反应管中进行并观测结果。

本发明只需要用1套引物，即可扩增所有的NDV F基因，并通过针对强弱毒株的F基因裂解位点特异序列的taqman探针只分别与强毒株和弱毒株序列杂合，反应过程中杂合探针水解释放游离荧光基团。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过taqman杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响。而“新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立”中用SYBR GREENⅠ，则不能对这些非特异性扩增或引物二聚体导致的假阳性加以区分。

总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。