生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3和6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，因而可用于鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的防治有重要意义。

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是危害病原。该病主要侵害产蛋鸭和雏鸭，引起产蛋鸭产蛋急剧下降和少量死亡，导致产蛋鸭高淘汰率，自2010年爆发以来严重危害养鸭业。减蛋综合症病毒(Egg Dropping Syndrome Virus，EDSV)，同样引起产蛋鸭的产蛋下降。鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒感染产蛋鸭后，引起相似的症状即产蛋下降，因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒检测方法，以便在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方法有病毒分离、琼脂扩散试验等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒进行检测和诊断的报道。

本发明具有如下优点：

1)检测时间短

应用本发明可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约30分钟，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还得花2小时进行凝胶电泳来观察结果；

2)检测敏感性高且特异性强

当鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个病毒检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的检出及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性非常高，均能检测到200个拷贝的鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒，比常规PCR方法敏感性高10倍，因而可用于鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒的防治有重要意义。