生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了一种用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。本发明保护一种引物组合，包括13个引物对(26种引物)，26种引物依次如序列表的序列1至序列26所示。应用本发明提供的引物组合配套GeXP检测方法鉴定H5、H7和N9亚型组合9个NA亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别H5、H7和N9亚型组合9个不同的NA亚型AIV提供了有效方法，应用前景广阔。

禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科A型流感，根据HA和NA抗原性不同，目前，已在禽类发现16个HA亚型和9个NA亚型，近年，在蝙蝠发现第17、18个HA亚型和10、11个NA亚型。1997年香港出现人类感染H5N1亚型AIV死亡病例，并爆发疫情，使人“谈禽色变”，给养殖业造成严重的经济损失。近年来，AIV感染人的病例陆续有报道，2013年，在我国长三角地区发现H7N9感染人并致死的案例，并在全国大部分地区扩散开来，已引起5波的感染，目前，仍有H7N9感染人的报道，给公共卫生安全造成严重的威胁。H9N2是AIV分离中常见的亚型，为近年感染人的H7N9、H10N8提供基因片段。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(DNA SizeStandard,DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。

为了建立H5、H7和N9亚型组合9个NA亚型禽流感病毒GeXP检测方法，本发明的发明人提供了13对特异性引物，13对特异性引物组成引物组合。本发明的发明人对于引物组合进行了特异性、敏感性、干扰性、稳定性验证。13重反应体系能对应扩增出单一、几种随机混合、13种混合的核酸模板，特异性强，对常见的禽病病原体新城疫病毒、传染性支气管炎病2毒等不存在交叉反应。同时鉴别13种目的基因的检测下限为10拷贝/μL。对不同浓度的不同模板同时进行检测，与单一模板的检测无明显差别，表明13重引物之间干扰性小。在同一时间和不同时间对相同模板进行检测，表明重复性好，稳定性佳。应用本发明提供的引物组合配套GeXP检测方法可以在同一个反应体系中进行13重PCR扩增，有效鉴定H5、H7和N9亚型组合9个NA亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别H5、H7和N9亚型组合9个不同的NA亚型AIV提供了有效方法，应用前景广阔。