用于检测H7以及5个NA亚型AIV的引物组合及其应用
禽流感病毒(Avian Influenza viruses,AIVs)是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒,病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。根据A型流感病毒表面糖蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性不同,目前,已在禽类发现16个HA亚型和9个NA亚型,近年,在蝙蝠发现第17、18个HA亚型和10、11个NA亚型。禽流感据其临床症状分为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI)。H7亚型AIV可引起HPAI,给人类健康造成严重威胁,如自2013年以来爆发的H7N9亚型AIV,从长三角地区发现人感染并致死的病例,逐渐传播至全国大部分省份,给养殖业造成严重的经济损失。国家卫生计生委通报在2018年2月10‑14日期间确诊一宗人类感染A型禽流感H7N4个案,这宗是全球首宗人类感染A型禽流感(H7N4)个案。H7N2、H7N3、H7N7亚型AIV均有感染人的报道。目前,已发现H7亚型可组合N2、N3、N4、N7和N9亚型感染人,因此,如果提供在一个反应管同时检测H7、N2、N3、N4、N7和N9亚型的引物组合,用于这些亚型的快速鉴别检测具有重要意义。
H7亚型禽流感(Avian influenza,AI)与5个NA亚型的组合(H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9)能感染人,具有重要的公共卫生意义。为了建立一种同时鉴别H7、N2、N3、N4、N7和N9亚型AIV的高通量检测方法,本发明的发明人提供了7对特异性引物,7对特异性引物组成引物组合。本发明的发明人对于引物组合进行了特异性、敏感性、干扰性、稳定性验证。7重反应体系能对应扩增出单一、几种随机混合、7种混合的核酸模板,特异性强,对常见的禽病病原体新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等不存在交叉反应。同时鉴别7种目的基因的检2测下限为10 拷贝/μL。对不同浓度的不同模板同时进行检测,与单一模板的检测无明显差别,表明7重引物之间干扰性小。在同一时间和不同时间对相同模板进行检测,表明重复性好,稳定性佳。应用本发明提供的引物组合配套GeXP检测方法可以在同一个反应体系中进行7重PCR扩增,有效鉴定H7亚型、N2亚型、N3亚型、N4亚型、N7亚型、N9亚型,具有高通量、快速、省时省力的优点,为快速鉴别H7亚型、N2亚型、N3亚型、N4亚型、N7亚型、N9亚型AIV提供了有效方法,为大批量的流行病学监测提供有效方法,应用前景广阔。
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