生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法。本发明设计筛选出的引物组合物包括2组特异性引物和探针，在本发明优选的反应体系和反应条件下，能够在同一反应管中同时鉴别检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型，具有特异性好、灵敏度高、抗干扰、无污染、操作简便快速、成本低等特点。

水泡性口炎是由弹状病毒科(Rhabdoviridae)水泡病毒属(Vesiculovirus)的水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)引起的多种哺乳动物的高度接触性传染病。VSV可以自然感染牛、猪、马及其他哺乳动物，此外昆虫和植物也是VSV潜在的贮存者,节肢动物媒介也可以传播VSV。该病可以引起感染动物舌部、口腔、蹄部和乳房出现水泡以及溃疡，并使患畜丧失生产力，且很难在临床症状上和口蹄疫进行区别，已经被世界卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，在我国该病属于外来病，在进出口检疫中被列为二类必检传染病。VSV可分为两个血清型：印第安纳型(Indiana,IND)和新泽西型(New Jersey,NJ)，两个血清型间的同源性很低，型内的同源性很高。不同血清型的VSV对动物体的致病性各有不同。快速、准确区分VSV的不同血清型可及时掌握其流行特点，从而制定对应的防控策略。因此,有必要建立VSV分型检测技术。

本发明具有以下优点：

1继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低，减少污染，反应后直接凭肉眼读取反应结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP的污染，可在基层条件差的地方现场检疫。

2特异性高：探针的杂交比引物扩增更特异，能有效抑制假阳性结果。通常当延长LAMP反应时间，由于引物间相互缠绕，反应会出现非特异性扩增。在研究中，我们尝试延长反应时间至120分钟，在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，非特异性扩增的反应管内探针不会断裂，因此不能发光，由此可见该二重荧光RT‑LAMP方法特异性较好。

3本发明通过对环介导等温扩增反应体系的优化，尤其是采用了Bst DNA3.0聚合酶后，检测灵敏度得到极大提高，可达1个拷贝/反应。

4结果准确：本研究使用了新型的探针：分子信标探针，这种探针比普能的Taqman探针更特异，可识别1个碱基的差异。分子信标探针标记了两种荧光基团，FAM和CY5.5,这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FAM吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为694nm，呈大红色不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FAM，无法观察到CY5.5。比仅凭沉淀物观察,电泳等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。