生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了一种用于检测9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。本发明保护一种引物组合，包括10个引物对(20种引物)，20种引物依次如序列表的序列1至序列20所示。应用本发明提供的引物组合配套GeXP检测方法鉴定9个NA亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别9个不同的NA亚型AIV提供了有效方法，应用前景广阔。

禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科A型流感，根据HA和NA抗原性不同，目前，已在禽类发现16个HA亚型和9个NA亚型，近年，在蝙蝠发现第17、18个HA亚型和10、11个NA亚型。1997年香港出现人类感染H5N1亚型AIV死亡病例，并爆发疫情，使人“谈禽色变”，给养殖业造成严重的经济损失。近年来，AIV感染人的病例陆续有报道，2013年，在我国长三角地区发现H7N9感染人并致死的案例，并在全国大部分地区扩散开来，引起5波的感染，目前，仍有H7N9感染人的报道，给公共卫生安全造成严重的威胁。H10N8、H6N1也有首次感染人的报道。

AIV是分节段的病毒，分为8个基因片段，不同亚型AIV具有相互交换基因片段的能力，从而产生致病性未知的AIV。因此，AIV的监测对于有效防控该病具有重要意义，建立AIV的快速检测方法作为技术储备十分必要。目前，AIV的流行病学调查，通常是采集样品接种SPF胚进行病毒分离，通过HA和HI试验鉴定出H亚型，N亚型的鉴别方法非常有限。传统检测NA亚型AIV的方法主要是神经氨酸酶抑制试验(NI)，是国际兽疫局推荐的金标准检测方法，但耗时并需要特定的阳性血清。

为了建立一种同时鉴别禽流感9个NA亚型的GeXP检测方法，本发明的发明人提供了10对特异性引物，并对10对引物形成的引物组合的多重反应体系进行特异性、敏感性、干扰性、稳定性验证和临床样品检测。10重反应体系均能对应扩增出单一、几种随机混合、9种混合的核酸模板，与预期设计相符。特异性强，对常见的禽病病原体新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等不存在交叉反应。同时鉴别10种目的基因的检测下限为102拷贝/μL。对不同浓度的不同模板同时进行检测，与单一模板的检测无明显差别，表明10重引物之间干扰性小。在同一时间和不同时间对相同模板进行检测，表明重复性好，稳定性佳。应用本发明提供的引物组合配套GeXP检测方法可以在同一个反应体系中进行10重PCR扩增，有效鉴定9个NA亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别9个不同的NA亚型AIV提供了有效方法，应用前景广阔。