生物、医药和医疗器械技术

本发明公开了一种可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光RT‑LAMP检测组、试剂盒及其应用，该二重荧光RT‑LAMP检测组包括2组特异性引物和探针，其中第一组特异性引物和探针包括FMDV‑F3，FMDV‑B3，FMDV‑FIP(F1c‑F2)，FMDV‑BIP(B1c‑B2)，和FMDV‑探针，第二组特异性引物和探针包括BTV‑F3，BTV‑B3，BTV‑FIP(F1c‑F2)，BTV‑BIP(B1c‑B2)和BTV‑探针，所述2组特异性引物和探针依次如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示，该二重荧光RT‑LAMP检测组能够在同一反应管里鉴别诊断口蹄疫病毒和蓝舌病病毒，具有特异性好、敏感性高、污染小、方便快捷等优点，并且检测结果可直接用肉眼观察，根据反应产物颜色判断结果，可应用于条件简陋的基层检疫。

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease，FMDV)引起的偶蹄类动物共患的急性高度接触性传染病，具有传播广、发病急、危害大等流行病学特点，主要感染牛、猪、羊和骆驼等个20科的70多种家养和野生哺乳动物。蓝舌病是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的反刍动物非接触性传染病，可通过库蠓等昆虫染感宿主，主要感染绵羊、牛及野生反刍动物。两种病毒感染动物均表现为体温升高，精神沉郁，口腔黏膜、乳头和蹄部出现水泡溃烂，症状相似，难以区分。被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，在中国被列为一类动物疫病。FMDV一旦暴发，只能通过屠宰和集体焚毁的方式进行处理，BTV一般呈隐性感染，但在我国多个省份广泛存在，时时危害着畜牧业的健康发展。

LAMP是2000年Notomi等人开发出的一种新型核酸扩增方法，恒温扩增，操作简便，反应快速，成本低，已广泛应用在疾病诊断和基因筛选中。但LAMP由于其结果判定方法的局限(浊度，颜色，加染料)，多重LAMP方法一直未有较大进展。虽然目前国内外多位学者已建立了多重LAMP检测方法，但这些方法都有一定的不足：只能检测样品是否带病，但不能确定具体是哪一种病原引起的结果。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明涉及的RT-LAMP检测组采取的是一种新的技术路线：在FIP与BIP之间添加Taqman探针，反应前荧光基团与淬灭基因紧密相邻，此时探针中的荧光基团不发光，LAMP反应中，探针分子杂交到靶序列上，引物延伸，使探针断裂，荧光基团与淬灭基团分开，荧光基团发光。LAMP扩增效率极高，扩增产物的数量比real-time PCR多，断裂的探针数量多，因此能在反应管内凭肉眼可直接读取反应结果，不需要电泳，且荧光基团所显示颜色的不同能准确鉴别两种病毒。该二重荧光RT-LAMP检测组的优点：1继承了LAMP的优点：简便、快速、灵敏、成本低。2特异性高：探针的杂交比引物扩增更特异，能有效抑制假阳性结果。通常当延长LAMP反应时间，由于引物间相互缠绕，反应会出现非特异性扩增。在研究中，发明人尝试延长反应时间至120分钟，在实时浊度仪上能监测到非特异性扩增的浊度曲线，但反应结束后，在多色荧光成像分析系统下，非特异性扩增的反应管内探针不断裂，因此不能发光，由此可见该二重荧光RT-LAMP方法特异性较好。3减少污染，反应后直接凭肉眼读取反应结果，不需要电泳或开盖添加染料，大大降低LAMP的污染。4结果准确：本研究使用了两种荧光基团，FAM和CY5.5，这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FAM吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5.5吸收波为694nm，呈大红色不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，即在520通道下只能观察到FAM，无法观察到CY5.5。比仅凭沉淀物观察，电泳等方式更准确，是第一次实现了真正意义上的多重LAMP鉴别检测。

(2)本发明用FMDV和BTV病毒体外转录RNA对二重荧光RT-LAMP检测方法的特异性、敏感性等方面进行评估，用临床样品和模拟混合感染样品验证方法的临床检测效果。结果显示，两种病毒体外转录RNA最低检测限为200拷贝/反应；特异性好，与其它病毒无交叉反应；干扰性小，可同时检测到两个模板浓度不同的样品；该方法方便快捷，全程仅需一台水浴锅90分钟完成反应，且不需要电泳，肉眼直接观察反应产物判断结果；与OIE推荐荧光定量RT-PCR方法检测符合率100％。结果表明本研究建立的FMDV和BTV多重荧光RT-LAMP具有良好的特异性，敏感性和重复性，可用于条件简陋的基层检疫。